Kwasy nukleinowe

I KWASY NUKLEINOWE

1.1.Kwasy Nukleinowe

Naukowcy nie byli zainteresowani tą dziedziną nauki jaką są kwasy nukleinowe. Dopiero po odkryciu Avery’ego , który wykazał u bakterii zjawisko transformacji, dziedzina ta zaczeła być badana. Avery wykazał, że jeśli do pożywki, na której hodujemy określony szczep bakteryjny dodamy DNA ze szczepu o innych właściwościach dziedzicznych, to komórki są zdolne do wprowadzenia obcego DNA do swego wnętrza. Komórki, które pobrały obce DNA mogą zastąpić niewielki odcinek własnego DNA obcym DNA pobranym z pożywki. Jeśli we włączonym odcinku DNA znajdował się gen odróżniający szczep dawcy DNA od szczepu biorcy, to komórki uzyskują właściwości szczepu dawcy. Jest to zmiana trwała, dziedziczna występująca już we wszystkich komórkach potomnych zmienionej komórki. Zjawisko to nazwano transformacją. W wyniku włączenia odrębnego odcinka DNA komórka nabiera zdolności wytwarzania nowego odrębnego białka. A więc w DNA znajduje się informacja o zdolności syntezy białek. DNA jest związkiem o bardzo dziwnych i specjalnych właściwościach. W komórkach bakterii czy cząstkach wirusów występuje tylko jedna jego cząsteczka. Jest to cząsteczka bardzo trwała, częściowo wyłączona z metabolizmu poza okresem kiedy zostaje powielona, czyli replikowana na dwie potomne cząsteczki. Proces replikacji DNA zwykle poprzedza podział komórkowy i do potomnych komórek bakterii znów zostają przekazane pojedyncze kopie DNA. Podobnie dzieje się z DNA w chromosomach wyższych organizmów. Występuje on w tej samej ilości w jądrze i komórce i podwajają się przed podziałami komórkowymi, a po podziale występuje znowu w tej samej ilości w komórkach potomnych. Aby wyjaśnić zachowanie się i rolę DNA w komórkach trzeba było dokładnie poznać jego molekularną strukturę. Śladami Avery’ego szli również naukowcy Watson i Crick, którzy to w oparciu o wyniki analiz chemicznych jak i obrazy rentgenograficzne cząsteczek DNA zaproponowali model jego struktury. Dziś wiemy, że DNA jest długim polimerycznym łańcuchem złożonym z licznych podjednostek zwanych nukleotydami. Występują w DNA cztery rodzaje nukleotydów. Wszystkie zawierają tę samą cząsteczkę cukru desoksyrybozy i resztę kwasu fosforowego, a różnią się jedynie przyłączoną do cukru cząsteczką zasady azotowej purynowej (adenina lub guanina) bądź pirymidynowej (tymina lub cytozyna). W łańcuchu polinukleotydowym sąsiednie nukleotydy są połączone resztami kwasu fosforowego. Watson i Crick wykazali, że w cząsteczce DNA występują dwa łańcuchy polinukleotydowe spiralne naokoło wspólnej osi skręcone, które się nawzajem uzupełniają, czyli komplementują. Oznacza to, że zawsze naprzeciw nukleotydu z puryną w jednym łańcuchu w drugim łańcuchu znajduje się nukleotyd z pirymidyną (T) a zaś naprzeciwko nukleotydu z puryną (G) znajduje się w drugim łańcuchu nukleotyd z pirymidyną (C).O ile nukleotydy w obrębie jednego łańcucha są powiązane trwałymi wiązaniami to oba uzupełniające się łańcuchy są połączone bardzo słabymi wiązaniami wodorowymi między parami zasad A i T oraz G i C. Ta struktura molekularna tłumaczy wszystkie właściwości DNA jako związku chemicznego związanego z dziedzicznością. Przede wszystkim dwoistość jego struktury nadaje mu zdolność do samopowielania się, czyli replikacji. Kolejność ułożenia nukleotydów w jednym łańcuchu DNA wyznacza automatycznie kolejność w drugim uzupełniającym łańcuchu. Gdy słabe wiązania wodorowe między zasadami z dwóch łańcuchów DNA zostaną zerwane wtedy każdy z pojedynczych łańcuchów może być wzorcem, czyli matrycą dla odtworzenia drugiego uzupełniającego łańcucha. W ten też sposób odbywa się replikacja DNA. Na jednym starym łańcuchu jako wzorcu specjalny enzym- polimeraza DNA układa i łączy wolne nukleotydy w drugi komplementarny łańcuch polinukleotydowy. W ten sposób z jednego podwójnego łańcucha DNA powstają dwa podwójne potomne łańcuchy DNA, z których każdy zawiera jeden stary i drugi nowo syntetyzowany. A więc struktura molekularna DNA warunkuje możność jego precyzyjnej replikacji i wyjaśnienia, w jaki sposób w potomnych komórkach występują identyczne kopie DNA. Jest to podstawowy warunek dla substancji, która ma spełniać rolę w zjawiskach dziedziczności. Następne pytanie, jakie należy sobie postawić, to jaką rolę biologiczną spełnia DNA w komórkach. W całym świecie ożywionym (z wyjątkiem niektórych wirusów) cząsteczki DNA posiadają tę samą strukturę ogólną i złożone są z tych samych nukleotyduw i replikują się w identyczny sposób. Łańcuchy DNA z różnych organizmów różnią się długością oraz przede wszystkim kolejnością, czyli sekwencją nukleotydów w łańcuchach. Organizmy najprostsze, jak mają najkrótszy DNA złożony z 5 do 100 tysięcy par nukleotydów, DNA bakterii składa się już z 3-4 milionów par nukleotydów, podczas gdy wyższe organizmy, jak na przykład ssaki z człowiekiem włącznie posiadają z 2-3 miliardów par nukleotydów. Jeśli DNA zawiera jakąś informację genetyczną to jest zrozumiałe, że bardziej złożone organizmy muszą posiadać więcej informacji. W latach sześćdziesiątych wyjaśniono, w jaki sposób informacja genetyczna jest zapisana, czyli inaczej zakodowana w DNA. Okazało się, że w DNA przede wszystkim jest zapisana informacja o sekwencji aminokwasów w polipeptydach wszystkich białek syntetyzowanych przez dany organizm. Poszczególne odcinki łańcucha DNA stanowiące poszczególne geny zawierają informację o syntezie poszczególnych białek. Geny ułożone są w DNA liniowo w ściśle określonej kolejności. Poszczególne geny również różnią się ilością, a przede wszystkim kolejnością ułożenia, czyli sekwencją nukleotydów w DNA genu. Kolejność ułożenia nukleotydów w genie wyznacza kolejność aminokwasów w polipeptydzie , który dany gen koduje. Oczywiście powstaje natychmiast pytanie, w jaki sposób cztery różne nukleotydy występujące w DNA mogą kodować 20 różnych aminokwasów występujących w białkach ? Jest to identyczny problem jak zaszyfrować za pomocą czterech znaków słowa pisane alfabetem 20 znakowym. Na pytanie to w wyniku licznych bardzo pomysłowych doświadczeń otrzymano jednoznaczną odpowiedz obowiązującą w całym świecie ożywionym. Mianowicie wzdłuż cząsteczki DNA trójki kolejnych nukleotydów oznaczają sygnały dla włączania kolejnych aminokwasów w syntetyzowanym łańcuchu polipeptydowym białka . Różnych trójek nukleotydów zwanych kodonami może być 4 do potęgi 3 , czyli 64. Ponieważ różnych aminokwasów jest tylko 20 to okazało się, iż jeden aminokwas mogą wyznaczać 2,4 a nawet 6 różnych kodonów o znaczeniu synonimowym. Trzy określone kody nie oznaczają żadnego aminokwasu i służą jako sygnały zakończenia zapisu o syntezie polipeptydu.

Wykazanie, iż w DNA znajduje się zapis o syntezie białek i następne ustalenie zasady kodowania aminokwasów przez trójki nukleotydów jest jednym z największych odkryć w całej biologii . Dalszym istotnym odkryciem biologii molekularnej było zbadanie roli różnych rodzajów kwasu rybonukleinowego ( RNA ) w procesie syntezy białek . Wykazano, że DNA nie stanowi bezpośredniej matrycy dla syntezy białek , ale zapis z DNA zostaje najpierw skopiowany na tzw matrycowe RNA ( m RNA) , które stanowi bezpośrednią matrycę dla syntezy białek. RNA jest zawsze jednołańcuchowy i nie może się sam odtwarzać jak to zachodzi w wypadku DNA. Matrycą dla syntezy RNA jest DNA. Dopiero m RNA wchodzi w kontakt z rybosomami, które stanowią aparat do wyróżniania kolejnych trójek w m RNA i umożliwiają syntezę polipeptydów. RNA jest również łańcuchem polinukleotydowym, z tym że w nukleotydach zamiast cukru desoksyrybozy występuje ryboza a poza tym zamiast zasady pirymidynowej tyminy występuje uracyl. Proces syntezy polipeptydów jest bardzo złożony i bierze w nim udział oprócz rybosomów i m RNA cały szereg enzymów. Nie wchodząc w szczegóły tego złożonego procesu, trzeba zwrócić uwagę na jedną istotną sprawę. Pojedyncze wolne aminokwasy występujące w komórce nie mają bezpośrednio żadnego powinowactwa do trójek nukleotydów w m RNA, które wyznaczają ich pozycje w syntetyzowanym polipeptydzie. Nim zostaną dostarczone do rybosomów zostają one najpierw połączone z innego rodzaju RNA tak zwanym transportującym lub przenośnikowym RNA (t RNA). Są to bardzo interesujące cząsteczki RNA. Składają się one zaledwie z 70-80 nukleotydów, ale które przyjmują bardzo skomplikowaną budowę przestrzenną. Wzdłuż łańcucha t RNA znajdują się liczne odcinki o sekwencjach nukleotydowych wzajemnie komplementarnych. Odcinki te tworzą struktury dwułańcuchowe podobnie jak w DNA, z tym że jedna nić t RNA ulega licznym wygięciom i skrętom tworząc pętle jednołańcuchowe i odcinki dwułańcuchowe. Cała cząsteczka przybiera więc bardzo skomplikowaną strukturę drugo i trzeciorzędową podobnie jak to się obserwuje w cząsteczkach białek. I znowu wracamy do zasadniczego problemu biologii molekularnej powiązania specyficznych funkcji ze specyficzną strukturą molekularną. Liczne odrębne cząsteczki t RNA o odrębnej sekwencji nukleotydowej przybierają odrębne struktury trzeciorzędowe. Te struktury rozpoznawane są znowu przez odrębne, specyficzne enzymy, które do odpowiednich t RNA przyłączają odpowiednie aminokwasy. Aminokwas połączony z t RNA, posiada trójkę nukleotydów komplementarną do jego kodonu w m RNA może teraz po doprowadzeniu do rybosomów odnaleźć swój kodon i zostać włączony w odpowiednim miejscu do rosnącego polipeptydu. Przedtem aminokwas oczywiście zostaje odłączony od swojego t RNA przez odpowiedni enzym i uwolniony t RNA może być ponownie połączony z następną cząsteczką aminokwasu. Dzięki swej wysoce specyficznej strukturze cząsteczka t RNA może więc transportować aminokwas i przyczyniać się do włączenia go w odpowiednim miejscu polipeptydu. Gdyby odpowiednie białka enzymatyczne nie dołączały aminokwasów do im właściwych t RNA odczytywanie kodu byłoby niemożliwe albo obarczone taką ilością błędów, że większość cząsteczek białka miałaby różną sekwencję aminokwasów. Tymczasem proces ten odbywa się bardzo precyzyjnie i ilość błędów w procesie odczytywania zapisu w m RNA przez enzymy łączące je z aminokwasami musi być bardzo precyzyjne. Zasada odczytywania zapisu o syntezie białek nie bezpośrednio z matrycy DNA, ale z m RNA ma głęboki sens biologiczny. DNA w komórce bakterii występuje w jednej kopii a u wyższych diploidalnych organizmów w dwóch kopiach przy czym jest to związek bardzo trwały i można by powiedzieć, że dzięki samoodtwarzaniu się właściwie wiecznie trwały w przeciwieństwie cząsteczki m RNA są bardzo nietrwałe. U bakterii żywot jednej cząsteczki m RNA wynosi średnio parę minut. Poza tym z DNA jednego genu mogą powstać w komórce liczne cząsteczki mNRA kodującego jedno i to samo białko. Komórka może więc w krótkim czasie uruchomić intensywną syntezę określonych białek. Z drugiej strony komórka może regulować jakość wytwarzanych białek. Jeśli odcinek DNA z genami na pewne białka nie zostaną przepisane na m RNA to synteza tych białek w komórce nie będzie zachodzić. Poza tym komórka może szybko wyhamować lub zainicjować syntezę różnych białek przez zahamowanie lub rozpoczęcie syntezy odpowiednich rodzajów m RNA. Skoro cząsteczki m RNA istnieją tylko parę minut to po zaprzestaniu ich syntezy w ciągu paru minut ustanie także synteza kodowanych przez nie białek. W ten sposób komórka może szybko przystosować się do zmieniających warunków otoczenia. Dotyczy to zarówno wolno żyjących jednokomórkowych bakterii jak i procesów różnicowania się komórek w trakcie rozwoju organizmu wielokomórkowego. Te niesłychanie interesujące i złożone procesy regulacji odczytywania zapisu genetycznego z DNA w czasie życia jednej komórki, czy różnicowania się komórek wyższych organizmów sprowadzają się w zasadzie do licznych czasem bardzo złożonych współdziałań między kwasami nukleinowymi a białkami.

Te współdziałania muszą być bardzo precyzyjne i specyficzne. Polegają one znowu na rozpoznawaniu określonych struktur pierwszo- drugo- czy trzeciorzędowych kwasów nukleinowych przez odpowiednie bardzo specyficzne struktury odpowiednich cząsteczek białkowych. A więc znowu decydującą rolę w tych zjawiskach odgrywają struktury molekularne zdolne do wzajemnego rozpoznawania się i regulowania. Przedstawiamy to na kilku stosunkowo prostych przykładach.

1.2. BUDOWA I WŁASNOŚCI NUKLEOTYDÓW

Hydroliza kwasów nukleinowych prowadzi do pojedynczych nukleotydów, podobnie jak hydroliza białek- do pojedynczych aminokwasów. Nukleotyd wobec tego stanowi podstawową cegiełkę w budowie kwasów nukleinowych. Nukleotydy składają się z zasady organicznej, pentozy oraz reszty kwasu ortofosforowego. Zasady organiczne występujące w nukleotydach są pochodnymi pirymidyny i puryny i z tego względu rozróżnia się nukleotydy pirymidynowe i purynowe. W skład kwasów nukleinowych wchodzą następujące zasady pirymidynowe; cytozyna czyli 2- hydroksy – 6- aminopirymidyna, uracyl czyli 2,6- dwuhydroksypirymidyna i tymina, czyli 5- metylouracyl lub 2,6- dwuhydroksy- 5- metylopirymidyna. Jest spotykana również 5- metylocytozyna, a w kiełkach pszenicy 5- hydroksymetylocytozyna. Ponadto niektóre z wymienionych zasad występują w dwóch lub więcej formach tautomerycznych, np. uracyl. Jest to charakterystyczne zwłaszcza dla zasad pirymidynowych wchodzących w skład nukleotydów i kwasów nukleinowych, w których przy N-3 musi znajdować się wodór wymienialny z resztą cukru-rybozy (lub dezoksyrybozy) i wobec tego przy C-2 musi wystąpić forma ketonowa czyli laktamowa. Natomiast nazwy systematyczne tworzy się z reguły od form enolowych np. lewa forma uracylu-2,6 dwuhydroksypirymidyna. Z zasad purynowych, tzn. zbudowanych z dwóch skondensowanych pierścieni pirymidynowego i imidazolowego, należy wymienić adeninę, czyli 6-aminpurynę, guaninę czyli 2-amino-6-hydroksypurynę i hipoksantynę, czyli 6-hydroksypurynę. Nukleotydy zawierające zamiast rybozy, 2-dezoksyrybozę noszą nazwę dezoksyrybonukleotydów, a ich skróty zawierają na początku literę d, np. dAMP, dGMP. Nazwy i skróty podane w tabeli dotyczą nukleozydo-5-monofosforanów. W środowisku naturalnym spotyka się również nukleozydo-3-monofosforany i wtedy nazwy ich tworzy się z wykazaniem pozycji przyłączonej reszty fosforanowej, np. adenozyn-3-monofosforan, lub 3-AMP. Tak jak aminokwasy są podstawowymi cegiełkami w budowie cząsteczki białka, nukleotydy są zasadniczymi elementami przy budowie kwasów rybonukleinowych i dezoksyrybonukleinowych. Są one poza tymi związkami wyjściowymi w biosyntezie trójfosforanów nukleozydów, które jak wiadomo, stanowią najważniejsze związki wysokiej energii, np. ATP, GTP,UTP i inne. Ponadto wreszcie szereg nukleotydów wchodzi w skład licznych koenzymów, gdzie pełnią bardzo ważną rolę w przemianach enzymatycznych.

DNA i RNA wykazują strukturę liniową, tzn. są zbudowane z długich powiązanych ze sobą łańcuchów nukleotydów, przy czym sam łańcuch stanowią ułożone na przemian cząsteczki rybozy (lub dezoksyrybozy) i kwasu fosforowego, natomiast zasady pozostają na zewnątrz łańcucha. Poszczególne nukleotydy są więc ze sobą powiązane wiązaniami dwuestrowymi-poprzez kwas fosforowy, który jedną grupą OH łączy się z C3 cukru jednego nukleotydu , a drugą grupą OH z C5 następnego nukleotydu. Budowa wycinka łańcucha polinukleotydowego jest schematycznie i w postaci pwłnej struktury.

1.3. BIOSYNTEZA NUKLEOTYDÓW

Nukleotydy pirymidynowe i purynowe tworzą się w żywym ustroju zasadniczo oddzielonymi drogami. Związkami wyjściowymi nukleotydów pirymidynowych są kwas asparaginowy i karbamoilofosforan, które przy udziale enzymu karbamoilotransferazy asparaginianowej ulegają kondensacji do kwasu karbamoiloasparaginowego. Utworzony związek przy udziale ATP cyklizuje do kwasu dwuhydroorotowego, który następnie z udziałem dehydrogenazy współdziałającej z flawiną, ulega odwodorowaniu do kwasu orotowego. Kwas orotowy, który jest macierzystą substancją nukleotydów pirymidynowych, reaguje z 5-fosforybozylo-1-pirofosforanem i w wyniku tworzy się nukleotyd- orotydynomonofosforan OMP oraz pirofosforan. OMP po dekarboksylacji przechodzi w urydyno-5-monofosforan-UMP. Należy wspomnieć, że kwas orotowy- pośredni produkt tego ciągu reakcji- jest określany jako jedna z witamin grupy B a jego niezbędność w przemianie materii wynika właśnie z udziału w biosyntezie kwasów nukleinowych. UMP powstający w wyniku przedstawionych reakcji może z udziałem ATP ulec kolejnym fosforylacjom do UDP i UTP, biorą udział w przemianach cukrowców. UMP może również przekształcić się w inne nukleotydy pirymidynowe, np. przez aminację w pozycji 6 z udziałem glutaminy powstanie cytydyno-5-monofosforan-CMP, a przez metylację w pozycji 5 z udziałem koenzymu F i mrówczanu- tymidyno-5-monofosforan-TMP.

Zupełnie inaczej odbywa się biosynteza nukleotydów purynowych. Podczas, gdy w uprzednio opisanym przypadku najpierw był budowany pierścień pirymidynowy, do którego następnie przyłączał się rybozo-5-fosforan, w przypadku nukleotydów purynowych do cząsteczki rybozo-5-fosforanu, wchodzącego do reakcji w postaci PRPP, dobudowują się kolejne elementy pierścienia purynowego w następującej kolejności. Na wstępie do węgla glikozydowego rybozy dołącza się azot, stanowiący pozycję 9, a pochodzący z grupy amidowej glutaminy. Następnie przy udziale ATP dołącza się cząsteczka glicyny, a w dalszej reakcji z udziałem koenzymu F dobudowuje się jednowęglowy ostatni element pierścienia imidazolowego. Po dołączeniu azotu pochodzącego również z grupy amidowej glutaminy, stanowiącego pozycję 3, następuje z udziałem cząsteczki ATP zamknięcie pierścienia imidazolowego, po czym w odwracalnej reakcji i bez udziału koenzymu włącza się CO, tworząc pozycję 6 pierścienia pirymidynowego. Następnie dołącza się azot, pochodzący z grupy aminowej kwasu asparaginowego, tworząc pozycję 1 oraz węgiel mrówczanu z ponownym udziałem koenzymu F, dający pozycję 2 i wreszcie z udziałem ATP następuje zamknięcie pierścienia pirymidynowego. W wyniku opisanych przemian hipoksantynę, czyli inozyno-5- monofosforan-IMP. Wytworzone mononukleotydy przy sprzężeniu z egzoergicznymi reakcjami mogą przekształcić się kolejno w dwufosforany, a następnie w trójfosforany, np. AMP w ADP i ATP. Mogą one również, podobnie jak nukleotydy pirymidynowe, przy udziale odpowiednich enzymów polimeryzujących łączyć się z wytworzeniem wysokocząsteczkowego RNA. Wytworzone w opisanych przemianach nukleotydy z udziałem witaminy B12 ulegają przekształceniu do dezoksyrybonukleotydów, koniecznych do wytwarzania DNA. Przemiana ta odbywa się z udziałem czterech oddzielnych enzymów, na poziomie nukleozydodwufosforanów i bierze w niej udział specyficzne białko- tioredoksyna, która pośredniczy w przeniesieniu tlenu z rybozy na atomy wodoru. Tioredoksyna jest zbudowana z 108 aminokwasów i zawiera dwie grupy-SH, które przy reakcji służą jako dawca wodorów. Schematycznie przemianę tę można przedstawić reakcjami. Utleniona tioredoksyna ulega przy udziale enzymu reduktazy tiorredoksyny, która jest flawoproteidem i współdziała z FAD.

1.4.FUNKCJE KWASÓW NUKLEINOWYCH

Od wielu lat istnieją już dostateczne dowody, by twierdzić, że DNA jest nośnikiem informacji genetycznych. Oto ważniejsze z nich:
1. stwierdzona dopełnialność struktury w dwóch łańcuchach DNA doskonale nadaje się do powielania przy zachowaniu pewności, że w jego wyniku wytworzy się identyczny DNA, który wyposaży komórki potomne;
2. Wykazano, że w komórce w stanie spoczynku występuje stała ilość DNA, w okresie bezpośrednio przed podziałem – dwukrotnie większa i w gametach o pojedynczej liczbie chromosomów – dwukrotnie mniejsza;
3. w tzw. Transformacjach bakteryjnych wykazano, że właściwym czynnikiem infekującym faga jest DNA ( nawet gdy jest pozbawiony otoczki białkowej ), który przekazuje komórce gospodarza własne informacje.

II KWASY DEZOKSYRYBONUKLEINOWE- DNA

2.1. DNA

Powszechnie dziś przyjmowana struktura DNA została ustalona w 1953 roku przez Watsona oraz Cricka na podstawie badań rentgenograficznych Wilkinsa i chemicznych Chargaffa. DNA jest spotykany głównie w jądrze komórkowym, gdzie występuje w powiązaniu z zasadowymi białkami- histonami, odznaczającymi się wysoką zawartością aminokwasów zasadowych; argininy, lizyny, a zwłaszcza histydyny. Niedawno wykazano również obecność DNA w mitochondriach i chloroplastach, gdzie bierze on udział w samodzielnym systemie syntezy białek występujących w tych organellach.

Jak wspomniano, w skład DNA obok dezoksyrybozy i kwasu fosforowego wchodzą cztery zasady : adenina, guanina, cytozyna i tymina. Zawartość poszczególnych zasad w DNA różnych organizmów jest różna, natomiast w różnych tkankach jednego organizmu wskazuje znaczną stałość. W stosunkach ilościowych zasad występujących w DNA wykazano następujące regularności:
1. suma zasad purynowych ( A +G )= sumie zasad pirymidynowych ( T+ C ),
2. suma zasad z grupą 6- aminową ( A + C ) = sumie zasad z grupą 6- ketonową ( G+T),
3. ilość adeniny = ilości tyminy ( A = T ),
4. ilość guaniny = ilości cytozyny ( G = C )

Wynika z tego, że jedyny stopień w składzie zasad DNA stanowi stosunek A+T/G + C lub inaczej- stosunek A/G. W rzeczywistości w różnych organizmach stosunek ten jest różny i dlatego wyróżnia się DNA typu A-T i typu G-C, tzn. DNA o przewadze par A-T lub G-C. Jak to jest niżej wykazane typ G-C ma bardziej zwartą i mocniejszą strukturę niż typ A-T i dlatego w tym ostatnim sa częściej spotykane wszelkie modyfikacje struktury, prowadzące do tzw.mutacji organizmu. Kwasy dezoksyrybonukleinowe są związkami wielocząsteczkowymi- ich masy cząsteczkowe sięgają rzędu wielu milionów, a- jak się ostatnio okazało- astronomicznych liczb rzędu 10 do potęgi dziesiątej i większych. Badania rentgenograficzne Wilkinsa wykazały, że DNA występuje w komórce, podwójnych nici, zwiniętych w regularną spiralę i trwale ze sobą zespolonych. Przytoczone uprzednio regularności świadczą o występowaniu w strukturze DNA „ par zasad”, z których każda pochodzi z innego łańcucha i które są połączone ze sobą mostkami wodorowymi. Dwa zespolone łańcuchy DNA mają przeciwną polarność, bo- gdy jeden z łańcuchów jest skierowany od końca C5, zestryfikowanego kwasem fosforowym do końcowej grupy OH przy C3, z lewej strony na prawą- to drugi łańcuch ma kierunek odwrotny. Z takiej struktury wynika jedna z podstawowych cech DNA jako materiału genetycznego, a mianowicie; obydwa łańcuchy wzajemnie się dopełniają pod względem składu i kolejności występowania zasad. Znaczy to, że kolejność zasad w jednym łańcuchu ściśle określa ich kolejność w drugim, gdyż naprzeciw adeniny musi występować tymina, a naprzeciw guaniny- cytozyna. Znaczt to dalej, że każda nić DNA zawiera komplet odpowiadających sobie informacji, co może być wykorzystane przy podziale komórki.

III KWASY RYBONUKLEINOWE –RNA.

3.1. RNA

Kwasy rybonukleinowe RNA są związkami o co najmniej tak złożonej , budowie jak DNA lecz mają znaczenie mniejsze masy cząsteczkowe. Występują zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze komórkowym, choć większość z nich jest wytwarzana z reguły w powiązaniu z jądrem. Skład zasad w RNA różni się od DNA tym że zamiast tyminy występuje uracyl. Jeśli chodzi o regularność w stosunkach ilościowych poszczególnych zasad, to dla RNA jest aktualna tylko równoważność ilości zasad zawierających w pozycji 6 grupy aminowe z ilością zasad zawierających grupy ketonowe (A+C=G+U). Zróżnicowanie składu RNA jest w tym przypadku także znacznie większe i mniej związane z rodzajem organizmu, a bardziej z typem frakcji. RNA w przeciwieństwie do DNA występuje na ogół w postaci jednoniciowych łańcuchów, choć trafiają się i twory dwuniciowe (np. u wirusów).
RNA komórkowy można zasadniczo podzielić na trzy frakcje, w zależności od masy cząsteczkowej i funkcji, a mianowicie;

1. RNA przenoszący- tRNA (dawniej sRNA- rozpuszczalny), występujący z reguły w cytoplazmie i wykazujący masę cząsteczkową ok.25 000. Jego struktura, zarówno pierwotna, jak i wtórna jest stosunkowo dobrze poznana.
2. RNA informacyjny- mRNA ma masę cząsteczkową wynoszącą średnio ok. 300 000 i występuje zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie. Jego skład nukleotydowy jest dopełniający w stosunku do określonego odcinka DNA, w kontakcie z którym powstaje, a więc jego funkcja polega na przenoszeniu informacji zawartych w DNA do miejsc syntezy białka.
3. RNA rybosomowy- rRNA wykazuje najważniejszą masę cząsteczkową 0,5-2.10 do potęgi szóstej, występuje w rybosomach, gdzie pełni przypuszczalnie raczej funkcje strukturalne, gdyż w połączeniu z określonymi białkami i uprzednio wspomnianym mRNA stanowi matrycę, na której wytwarzają się łańcuchy polipeptydowe.

3.2. FUNKCJE RNA

Jak wspomniano, RNA komórki występuje w trzech podstawowych frakcjach, różniących się między sobą masą cząsteczkową i własnościami, a mianowicie jako RNA przenoszący (tRNA), informacyjny (mRNA). Ponieważ każda z tych frakcji pełni określoną funkcję w genetycznie kontrolowanej syntezie białka w komórce, należy je opisać bardziej szczegółowo.

RNA przenoszący – tRNA.
Jak wspomniano tRNA ma za zadanie przenoszenie aktywnych aminokwasów do miejsca syntezy białka, czyli rybosomów. Aktywacja aminokwasów odbywa się z udziałem enzymu syntezy aminoacylo – tRNA i ATP, według następujących reakcji.
Produktem przejściowym tej przemiany jest aminoacylo – AMP, w którym występuje bogate w energię wiązanie bezwodnikowe. Wykazano, że istnieje w komórce wiele enzymów aktywujących – początkowo sądzono, że co najmniej tyle, ile jest aminokwasów białkowych, a obecnie wiadomo, że znacznie więcej. Równie wiele występuje rodzajów tRNA, choć ich budowa różni się stosunkowo nieznacznie. Są to mianowicie cząsteczki o masie cząsteczkowej 25 – 30 000, zbudowane z 70 – 90 nukleotydów i występujące w formie pojedynczej nici. Skład zasad poszczególnych rodzajów tRNA wykazuje tylko niewielkie różnice, przy czym dla wszystkich obowiązują jednakowe zakończenia.

RNA Rybosomowy – rRNA.
Zgodnie z nazwą frakcja ta stanowi część składową tzw.rybosomów, w których odbywa się biosynteza białka. Są to maleńkie twory zbudowane z ok.40 – 60% RNA i w pozostałej części z białek; są one umiejscowione na powierzchni błon siateczki endoplazmatycznej. Występują zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze komórkowym, czy mitochondriach, a liczbę ich szacuje się na 5 – 50 000 sztuk w jednej komórce. W szybko dzielących się komórkach bakteryjnych rybosomy mogą stanowić do 30% suchej substancji komórki. Wielkość rybosomów komórek bakteryjnych wyraża się w stałej sedymentacji S = 70; a komórek roślinnych i zwierzęcych S = 80.
Rybosomy jako całość utrzymują się przy odpowiednio wysokim stężeniu Mg do potęgi drugiej +, natomiast przy niższym ich stężeniu rozpadają się na podjednostki – w przypadku komórek bakteryjnych – 30 S i 50 S, a w przypadku rybosomów 80 S – 40 S i 60 S. Jednakże w celu zainicjowania syntezy łańcucha polipeptydowego, rybosom musi ulec dysocjacji na podjednostki, a do mniejszej z nich ( 30 S lub 40 S ) przyłącza się matryca mRNA i aminoacylo – tRNA inicjujący. Wtedy następuje połączenie z pozostałą podjednostką i tworzy się aktywny układ polisomu.

RNA informacyjny – mRNA.
Ta frakcja została wykryta w 1958 r. przez Volkina i Astrachana w komórkach bakterii, bezpośrednio po zakażeniu fagiem. Wykazano wtedy, że frakcja ta nie była podobna do wcześniej poznanych frakcji RNA, natomiast składem zasad łudząco przypominała DNA faga, w stosunku do którego była dopełniająca (oczywiście w tym przypadku zamiast tyminy występował uracyl). Początkowo masę cząsteczkowa tej frakcji określano na ok. 300 000, obecnie jednak wiadomo, że jest ona bardzo zróżnicowana i wynosi od 100 000 do kilku milionów, w zależności od ilości jednorazowo przenoszonych informacji, tzn.od długości wytwarzanego łańcucha polipeptydowego.

IV Współdziałanie miedzy kwasami nukleinowymi a białkami

Replikacja DNA w komórce bakteryjnej jest dokładnie zsynchronizowana z podziałami i na określonej pożywce przy określonej temperaturze odbywa się w regularnych powtarzających się odstępach czasu. DNA bakterii jest koliste, nie ma początku ani końca, a jednak replikacja jego zaczyna się nie tylko w określonym momencie, ale i w ściśle określonym tym samym miejscu. Enzym replikujący – polimeraza DNA musi więc to miejsce rozpoznać. W procesie replikacji DNA u bakterii bierze udział kilka specyficznych białek rozpoznających odpowiednie miejsce w DNA zapewne na podstawie sekwencji nukleotydów a być może i struktury drugorzędowej. Łańcuchy DNA przed rozpoczęciem replikacji muszą być rozkręcone i w odpowiednich miejscach nacięte. U Escherichia Coli w procesie rozpoczęcia syntezy DNA jak i samej replikacji bierze udział około 10 różnych białek o specyficznym powinowactwie do DNA. Badając mutanty o zmienionych właściwościach tych białek można badać funkcje tych białek w procesie replikacji.

DNA mimo że nie bierze bezpośredniego udziału w metabolizmie, jest narażone na uszkodzenia pod wpływem różnych czynników fizycznych i chemicznych. Poza tym na skutek powiedzmy niedoskonałości działania polimerazy DNA mogą powstawać błędy w replikacji DNA i w nowo syntetyzowanym łańcuchu DNA mogą być włączone niewłaściwe nukleotydy. W wyniku takich uszkodzeń czy błędów powstają zmiany dziedziczne, czyli mutacje. Poziom zmian mutacyjnych w DNA musi być jednak niski, aby większość potomstwa posiadała te same geny co i rodzice. Toteż w komórkach istnieją liczne białka enzymatyczne reperujące uszkodzenia w DNA. Białka te muszą mieć zdolność rozpoznawania w DNA uszkodzeń powodujących minimalne zmiany w jego strukturze. Okazało się, że białka te potrafią wykryć w DNA na przykład jedną parę nie odpowiadających sobie nukleotydów i spowodować wycięcie jednego z tych nukleotydów. Następne białka reperujące wypełniają lukę w łańcuchu DNA na podstawie matrycy drugiego łańcucha tak iż powstaje normalna uzupełniająca się para nukleotydów. Są specjalne enzymy, które na przykład wycinają i reperują uszkodzenia powstające w DNA po napromieniowaniu komórki promieniami ultrafiołkowymi. W wyniku działania tych licznych enzymów reperujących DNA poziom mutacji jest utrzymywany na niskim poziomie. Brak tych enzymów powoduje znacznie większą wrażliwość komórek na różne czynniki uszkadzające DNA i ich większą śmiertelność. W tym wypadku białka zdolne są do wykrywania bardzo subtelnych zmian w strukturze DNA dotyczących nawet jednej pary nukleotydów.

Enzymy reperujące często nacinają DNA obok miejsca uszkodzonego, które następnie zostaje wycięte. Są to enzymy zwane nukleazami, które depolimeryzują łańcuchy DNA do pojedynczych nukleotydów. Niektóre nukleazy w komórkach bakteryjnych służą nie do reperowania własnego DNA, ale do niszczenia obecnego DNA, które może dostać się do wnętrza komórki, jak na przykład DNA wirusów bakteryjnych czyli fagów. Są to tak zwane enzymy restrykcyjne, które ostatnio zostały wykorzystane do bardzo interesujących doświadczeń. Enzymy te rozpoznają pewne określone sekwencje nukleotydów w DNA i w tych miejscach przecinała oba łańcuchy DNA, ale nie naprzeciwko siebie, lecz w miejscach przesuniętych w stosunku do siebie o kilka do kilkunastu nukleotydów. Zwykle tak pocięte obce DNA fagowe jest następnie atakowane przez inne nukleazy, które rozkładają go na pojedyncze nukleotydy. W ten sposób komórka bakteryjna może zniszczyć DNA faga.

Jeśli wyizolujemy enzym restrykcyjny to możemy za jego pomocą pociąć każdy DNA wirusowy, bakteryjny, roślinny czy zwierzęcy w tych miejscach, gdzie występować będą sekwencje nukleotydów rozpoznawane przez ten enzym. Z długich łańcuchów DNA powstaną wtedy różnej długości odcinki.

Odcinki te złożone z dwułańcuchowego DNA będą posiadały na obu końcach pojedyncze łańcuchy DNA o wzajemnie do siebie komplementarnych sekwencjach nukleotydów, gdyż enzym restrykcyjny przecina rozpoznawaną sekwencję w DNA w jednym łańcuchu na jej początku a w drugim jej końcu. Gdy pomieszamy w ten sposób pokrajane DNA z dwóch różnych organizmów to poszczególne fragmenty połączą się między sobą uzupełniającymi się jednołańcuchowymi odcinkami. W ten sposób wprowadzono do DNA na przykład fagów odcinek DNA z żaby. Po infekcji takim DNA komórek bakteryjnych wraz z wirusem w komórce bakterii replikowało się DNA żabie. W ten sposób można w komórkach bakterii namnażać DNA, a nawet pojedyncze geny pochodzące z najrozmaitszych organizmów. Stwarza to zupełnie nowe możliwości badawcze dla poznania struktury DNA i genów wyższych organizmów. Cała ta nowa technika tworzenia łączonych cząsteczek DNA jest możliwa dzięki temu, że dany enzym restrykcyjny precyzyjnie rozpoznaje i nacina tę samą strukturę w DNA.

Synteza białek, jak mówiliśmy, odbywa się na RNA, które jest przepisywane z DNA. Proces przepisywania, czyli transkrypcji odbywa się za pomocą specyficznego enzymu polimerazy RNA, która na matrycy jednego łańcucha DNA syntetyzuje komplementarny łańcuch RNA. Ponieważ w DNA znajdują się liczne geny, które nie wszystkie naraz podlegają transkrypcji, polimeraza RNA musi mieć zdolność rozpoznawania w DNA określonych miejsc, w których zaczyna się synteza mRNA. I w tym wypadku polimerazy RNA rozpoznają określone sekwencje nukleotydów w DNA jako miejsca wyznaczające początek miejsca transkrypcji. Zapewne miejsca te w DNA mogą mieć także specjalną strukturę przestrzenną rozpoznawaną przez polimerazę. Dzięki tym molekularnym zależnościom między strukturą DNA a strukturą białka procesy syntezy mRNA, a więc i białek mogą być precyzyjnie regulowane.

W komórce występują bardzo złożone systemy regulacyjne polegające na licznych wzajemnych zależnościach i sprzężeniach, zupełnie jak w złożonym komputerze, ale zminimalizowanym do rozmiarów jednej komórki. Na przykład mówiliśmy poprzednio, że jeśli do pożywki, na której hodujemy bakterię, dodamy aminokwasu histydyny, to na skutek połączenia się pierwszego enzymu w szeregu biosyntezy histydyny z histydyną zostanie on unieczynniony, co oczywiście przerywa syntezę histydyny. W tej sytuacji jednak dalej zarówno pierwszy, jak i dalsze enzymy konieczne do syntezy histydyny mogą być nadal syntetyzowane choć nie biorą udziału w syntezie. Byłoby to niepotrzebne marnotrawstwo. Toteż histydyna wywołuje jeszcze inny efekt, a mianowicie wyłącza wszystkie geny enzymów związanych z jej syntezą. Dzieje się to w ten sposób, że histydyna wyłącza syntezę mRNA dla wszystkich tych enzymów. W tym wypadku histydyna łączy się ze specyficznym białkiem zwanym represorem, które następnie łączy się z DNA obok miejsca, gdzie znajdują się geny tych enzymów. Białko represora w połączeniu z DNA blokuje syntezę odpowiedniego mRNA genów histydynowych. W ten sposób dopóki w środowisku znajduje nadmiar histydyny komórka w ogóle nie produkuje enzymów koniecznych do jej syntezy. W tym wypadku białko represora rozpoznaje z jednej strony cząsteczkę histydyny a z drugiej strony określoną sekwencję nukleotydów w DNA. Białko represorowe rozpoznaje tylko wtedy odpowiednią sekwencję w DNA, gdy jest połączone z histydyną. Gdy histydyna zostanie z pożywki wyczerpana i poziom jej w komórce spada wtedy histydyna oddziela się od białka represorowego. Białko represorowe zmienia wtedy swą konfigurację przestrzenną, traci powinowactwo do DNA. Na skutek oddzielenia oddzielenia represora od DNA zostaje umożliwiona transkrypcja, powstaje odpowiednie mRNA i zaczyna się synteza enzymów zwiazanych z wytwarzaniem w komórce histydyny. Znane są i odwrotne sytuacje przy regulacji innych dróg metabolicznych, gdzie specyficzne białko musi się najpierw połączyć z DNA, aby polimeraza RNA rozpoznała miejsce startowe i zaczęła syntezę właściwego dla danych enzymów mRNA. A więc cały szereg bodźców chemicznych wykorzystując właściwości białek regulacyjnych stanowi sygnały pozytywne bądź negatywne wyłączające lub włączające pojedyncze lub całe zespoły genów z procesu syntezy białek. Poznanie tych mechanizmów regulacyjnych stwarza możliwość otrzymywania szczepów bakteryjnych o zupełnie nowych właściwościach.

Gdy wszystkie te złożone mechanizmy zostaną wyjaśnione wtedy będziemy mogli poznać, w jaki sposób w komórce zygoty są zapisane nie tylko wszystkie właściwości złożonego organizmu, ale także w jaki sposób jest zaprogramowany z precyzją cały przebieg wzrostu i różnicowania się narządów, tkanek i komórek dorosłego organizmu. Nasza wiedza o procesach życiowych znacznie się wtedy pogłębi. Dużo z tych dziś jeszcze całkiem tajemniczych zjawisk da się być może sprowadzić do wzajemnego rozpoznawania się przez różnego typu związki chemiczne w pierwszym rzędzie między białkami i kwasami nukleinowymi.

Jednym z groźnych i do dziś tajemniczych zjawisk zachodzących w wyższych organizmach zwierzęcych jest proces powstawania komórek nowotworowych i powstanie raka. Komórki nowotworowe przestają reagować na liczne bodźce płynące do nich z organizmu i zaczynają się intensywnie dzielić i, jak wykazano, ich właściwości powierzchniowe są różne od komórek normalnych. Przez długie lata mimo licznych badań nie można było wyjaśnić mechanizmu powstawania komórek nowotworowych. W ostatnich latach wprowadzanie do badań nad rakiem pojęć i metod biologii molekularnej doprowadziło do szeregu nowych odkryć. Na przykład wykazano, że istnieje wirusów, których DNA jeśli po infekcji komórek zostanie włączone do DNA chromosomów zwierzęcia powoduje zamianę komórek normalnych w komórki nowotworowe. Niezwykle szybki postęp tych badań stwarza nadzieję na poznanie istoty raka i opracowanie metod jego zwalczania zarówno w organizmach zwierzęcych jak i ludzkim. Poznanie natury genów wirusów rakotwórczych i białek przez nie kodowanych będzie tu miało decydujące znaczenie.

Mówiąc o perspektywie, jakie biologia molekularna starza dla rozwoju całej biologii, medycyny i rolnictwa. Odrębność organizmów jest przejawem odrębności sekwencji nukleotydów w ich DNA, lub choćby w niektórych określonych genach, to będziemy mogli dokładniej określić, ile i jakiego rodzaju mutacji zaszło od czasu, gdy ich linie oddzieliły się od wspólnego przodka. Obecnie znamy sekwencję nukleotydową jedynie dla mniejszych wirusów. Znajomość sekwencji nukleotydów w naturalnych DNA jest jeszcze dziś bardzo fragmentaryczna. Jednak o podobieństwie sekwencji w DNA możemy z pewnym przybliżeniem wnioskować z sekwencji aminokwasów w białkach analogicznych występujących w różnych organizmach. Niektóre białka, jak powiedzmy hemoglobina, występują u wszystkich kręgowców. Odrębne łańcuchy polipeptydowe wchodzące w skład hemoglobiny są u różnych kręgowców bardzo podobne. Wskazuje to, iż wszystkie geny kodujące te łańcuchy pochodzą od wspólnego pragenu praprzodków kręgowców. W licznych pozycjach łańcuchów polipeptydowych hemoglobin występuje u wszystkich zwierząt zawsze te same aminokwasy. Dowodzi to, iż te właśnie aminokwasy w ściśle określonych położeniach są tak istotne dla biologicznych hemoglobin, że żadne zmiany ewolucyjne w tych miejscach nie są tolerowane i ewentualne mutacje są przez dobór naturalny usuwane. W innych pozycjach mogą jednak następować zamiany aminokwasów w wyniku mutacji w genach. Obliczono, ze w ewolucji hemoglobin zachodziło utrwalanie około 12 mutacji w ciągu jednego miliona lat ewolucji. Badania tego rodzaju przeprowadzane na różnych białkach, a w przyszłości na cząsteczkach DNA mogą wnieść istotne dane o pokrewieństwie organizmów i mechanizmach procesów ewolucyjnych.

Tak więc w ciągu zaledwie 40 lat swego istnienia biologia molekularna dokonała wielkich odkryć, a perspektywy dalszych badań są wprost nieograniczone.