"Badania mikrobiologiczne surowców i kosmetyków"

Kosmetykiem jest każda substancja przeznaczona do zewnętrznego kontaktu z ciałem człowieka: skórą, włosami, wargami, paznokciami, zewnętrznymi narządami płciowymi, zębami i błonami śluzowymi jamy ustnej, których wyłącznym lub podstawowym celem jest utrzymanie ich w czystości, pielęgnowanie, ochrona, perfumowanie, zmiana wyglądu ciała lub ulepszenie jego zapachu.
Kosmetyki w swoich prostych formach są znane od wieków, np. już w starożytnym Egipcie stosowano olej rycynowy jako balsam ochronny, Grecy jako pierwsi zastosowali specjalną mieszankę (wosk pszczeli, olej z oliwek i woda różana) do nacierania, która stanowiła pierwotną wersję kremu; jeszcze na początku XX wieku stosowano w celach kosmetycznych tłuszcz wytopiony z kuprów kaczek, zawierający składniki wygładzające skórę ? purcelinę ( mieszaninę estrów, które dzisiaj otrzymuje się syntetycznie). W rozwoju kosmetyków bardzo ważne było wprowadzenie do receptur takich substancji, jak: wazelina, lanolina, lecytyny i produkty roślinne oraz opracowanie sposobu utrwalania termodynamicznie niestabilnej formy jaką jest emulsja. Pierwszy krem będący emulsją typu woda w oleju (Nivea) wyprodukowano 1911 roku. W drugiej połowie naszego stulecia nastąpił dynamiczny rozwój pozyskiwania i wykorzystania w kosmetykach substancji biologicznie czynnych, np. witamin, protein, ceramidów, wyciągów lub ekstraktów z roślin, oraz w sposobie ich wprowadzania do kosmetyków, np. w postaci liposomów. W latach 70 nabrała znaczenia nowa grupa kosmetyków (kosmetoceutyków), do których są zaliczane te kosmetyki, które oprócz działania kosmetycznego wykazują działanie lecznicze lub wspomagające leczenie.
W dzisiejszych czasach produkcja dobrych kosmetyków pielęgnacyjnych wymaga bardzo dobrego warsztatu technologicznego. Obecnie kosmetyki coraz częściej produkuje się podobnie jak leki, w warunkach niemalże farmaceutycznych - dotyczy to przede wszystkim czystości i staranności produkcji. Jednak po to, aby kosmetyk był naprawdę bezpieczny i skuteczny potrzebne jest wsparcie zaplecza naukowego. Dlatego stwarza się nowoczesne laboratoria pozwalające na prowadzanie wielokierunkowych badań i doświadczeń w zakresie kosmetologii. Badania te prowadzone są pod kierunkiem lekarzy dermatologów, farmaceutów, biologów i chemików.
Niezmiernie ważną sprawą przy produkcji kosmetyków jest nie tylko pewność, że wytworzony preparat jest bezpieczny, ale także wiedza czy jest on skuteczny i jak faktycznie działa na skórę.
Czystość mikrobiologiczna kosmetyków jest jednym z ważniejszych problemów przemysłu kosmetycznego. Wynika to z faktu, iż większość preparatów kosmetycznych stanowi doskonałą pożywkę dla różnego rodzaju drobnoustrojów. Zagrożenie ze strony mikroorganizmów jest duże, gdyż mogą one nie tylko powodować obniżenie jakości wyrobów (aż do utraty ich właściwości użytkowych), ale mogą również stać się przyczyną poważnych infekcji użytkowników.
Wizualnym dowodem na to, że produkty kosmetyczne uległy zakażeniu lub zepsuciu są zachodzące w nich zmiany organoleptyczne. Do najczęściej obserwowanych należą: rozdzielenie faz, zmiana konsystencji, zapachu, barwy czy też pojawiające się w roztworach osady. W przypadku past, płynów do płukania ust czy pomadek wyczuwalna może być również zmiana smaku.
Niekorzystne zmiany zachodzące pod wpływem drobnoustrojów można zahamować dzięki zastosowaniu odpowiednich surowców kosmetycznych, m.in.:
związków chemicznych dodawanych w celu zapewnienia stabilności mikrobiologicznej produktu, będących właściwymi środkami konserwującymi (SK)
niektórych składników kosmetyków, które oprócz swoich podstawowych własności wykazują mniejsze lub większe działanie bakteriobójcze lub wspomagają działanie konserwantów.
Środki konserwujące są substancjami mającymi na celu zmniejszenie szybkości lub całkowite zahamowanie niekorzystnych zmian, głównie mikrobiologicznych, które powodują psucie wyrobu lub obniżenie jego jakości. Mają one za zadanie utrzymywać preparaty kosmetyczne w stanie pozbawionym zanieczyszczeń nie tylko podczas ich wytwarzania i pakowania, ale również podczas całego okresu ich stosowania, co jest szczególnie istotne w przypadku preparatów mających kontakt z oczami lub jamą ustną.
Badania mikrobiologiczne polegają na tym, aby oznaczyć ogólną liczbę drobnoustrojów tlenowych mezofilnych, Staphylococcus ureus, Pseudomonas aeruginosa oraz Candida albicans:
surowców
gotowego kosmetyku
oraz kryteria mikrobiologicznej czystości surowców i gotowego kosmetyku, a także metodę badań.
Raport z badań czystości mikrobiologicznej surowców i gotowego kosmetyku powinien zawierać następujące dane:
Dane identyfikacyjne laboratorium badawczego
Dane identyfikacyjne badanej szarży
Sposób pobrania próbki do badań
Metodę badawczą i sposób jej walidacji
Datę rozpoczęcia i zakończenia badań
Wyniki badań
Ocenę wyników lub ich interpretację
Własności fizykochemiczne oraz badania mikrobiologiczne należy wykonać w laboratoriach posiadających certyfikaty zgodności z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej (DLP) od polskiej Jednostki ds. Monitorowania DPL ? Biura do spraw Substancji i Preparatów Chemicznych.
Zasady Dobrej Praktyki Laboratoryjnej zostały po raz pierwszy opracowane przez Grupę Ekspertów ds. DLP powołaną 1978 r. w ramach Specjalnego Programu Kontroli Substancji Chemicznych, a ich podstawą stały się propozycje dla nieklinicznych badań laboratoryjnych opublikowane w 1976 r. przez FDA.
Jeżeli jest konieczne przeprowadzenie testu kontrolowanego zanieczyszczenia mikrobiologicznego, powinien być wykonany przez wykwalifikowaną osobę z użyciem kompletnej receptury wyrobu w opakowaniu handlowym, nawet jeśli prowadzone były wstępne badania tej receptury podczas opracowywania kosmetyku.
Zasadą jest wprowadzanie do wyrobu różnych mikroorganizmów: bakterii, drożdży, pleśni, wśród których mogą być użyte drobnoustroje chorobotwórcze lub powodujące zepsucie kosmetyku. W tak zanieczyszczonym produkcie badana jest przeżywalność mikroorganizmów w różnych okresach - tak długo, jak uważa się to za konieczne.
Z partii wyrobu powinny być pobierane próbki w momencie właściwym dla aktywności mikrobiologicznej receptury, zgodnie z ocenami dokonanymi w testach kontrolowanego zanieczyszczenia mikrobiologicznego i doświadczeniem produkcyjnym. Dla każdego nowego wyrobu należy określić częstotliwość badań w okresie początkowym, przynajmniej przez trzy miesiące, aby rozpoznać jakość mikrobiologiczną wyrobu w zwykłych warunkach produkcyjnych.

Zalecane wymagania czystości mikrobiologicznej i metody oceny gotowego wyrobu
Uwagi ogólne:
Celem wszystkich producentów musi być zagwarantowanie bezpieczeństwa wyrobów w zwykłych i możliwych do przewidzenia warunkach stosowania.
Zanieczyszczenia mikrobiologiczne mogą okazać się szkodliwe dla konsumenta i powodować zepsucie wyrobu, dlatego należy je ograniczać poprzez:
a) zachowanie higieny w zakładzie i procesie produkcyjnym,
b) odpowiednie zakonserwowanie wyrobu zapobiegające wzrostowi drobnoustrojów,
c) przestrzeganie granic czystości mikrobiologicznej w celu zapewnienia bezpieczeństwa wyrobu.
Podczas wykonywania pojedynczych badań producent musi pamiętać, że zanieczyszczające mikroorganizmy mogą być w fazie namnażania, statycznej lub zamierania. Użycie ŚK ma na celu niedopuszczenie do wzrostu drobnoustrojów. ŚK nie zastąpi dobra higiena w zakładzie produkcyjnym, trzeba również pamiętać, że użyte stężenie tych związków jest wypadkową między aktywnością przeciwdrobnoustrojową a bezpieczeństwem użytkownika. ŚK powinny być wybierane podczas opracowywania produktu, przy zastosowaniu testów kontrolowanego zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
Opisana niżej metodyka powinna być traktowana jako zalecana, producenci zaś mogą stosować własne metody kontroli wewnętrznej zapewniające produkowanie wyrobów zgodnych z kryteriami zawartymi w niniejszym załączniku.
Specyfikacja mikrobiologiczna odnosi się do środków kosmetycznych w nienaruszonym, zamkniętym opakowaniu.
Wyniki badań powinny być zapisywane w raporcie, który powinien zawierać następujące informacje, dotyczące:
a) identyfikacji próbek:
- rodzaj wyrobu,
- nazwę handlową,
- nazwę producenta,
- numer partii,
- datę i miejsce pobrania próbki,
- metody identyfikacji i warunki przechowywania,
b) warunków badań:
- datę,
- metodę,
- podłoże neutralizujące,
c) wyników testów.
Raport powinien zawierać wniosek oraz dane osoby odpowiedzialnej za badania.

Wymagania mikrobiologiczne
Wymagania ilościowe (minimalna wielkość badanej próbki - 1 g lub 1 ml)
KATEGORIA I. Kosmetyki przeznaczone dla dzieci i w okolice oczu
Ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 100 jtk/g lub ml (jtk - jednostki tworzące kolonie).
KATEGORIA II. Inne kosmetyki
Ogólna liczna drobnoustrojów tlenowych mezofilnych nie może przekraczać 1.000 jtk/g lub ml.

Bardzo ważna jest interpretacja wyników. Opisane ograniczenia powinny być interpretowane następująco:
102 - maksymalny limit akceptacji to 5 x 102,
103 - maksymalny limit akceptacji to 5 x 103.
Wymagania jakościowe
W 0,1 g lub 0,1 ml próbki kosmetyku nie mogą być obecne następujące drobnoustroje:
- Pseudomonas aeruginosa,
- Staphylococcus aureus,
- Candida albicans.
Kryteria akceptacji
Akceptowana jest jakość próbek, które spełniają wymagania jakościowe i ilościowe.
Metody badań mikrobiologicznych środków kosmetycznych
Określenie ogólnej liczby żywych drobnoustrojów tlenowych mezofilnych powinno być prowadzone według następujących zasad:
a) należy zachować ostrożność i unikać zanieczyszczenia produktu drobnoustrojami, które mogą być wykryte w próbce,
b) eliminacja każdej przeciwdrobnoustrojowej właściwości produktu w czasie analizy powinna być dokonana przez rozcieńczenie, zobojętnienie lub filtrację,
c) określenie ogólnej liczby żywych drobnoustrojów tlenowych mezofilnych prowadzi się, stosując techniki wylewania płytek, techniki posiewów powierzchniowych lub filtracji. "Wzbogacone" techniki nie są konieczne,
d) identyfikacja określonych mikroorganizmów jest prowadzona przy użyciu selektywnych podłoży hodowlanych.
Materiały i odczynniki
podłoża hodowlane i odczynniki,
przygotowanie próbki.
Ocena mikrobiologiczna powinna być przeprowadzona na próbkach wielkości minimum 1 g lub 1 ml.
Dla produktów o wadze mniejszej niż 1 g należy połączyć kilka próbek w celu otrzymania 1 g lub 1 ml.
Należy rozcieńczyć lub rozpuścić 1 ml lub 1 g wyrobu w mianowanym rozcieńczalniku neutralizującym w celu otrzymania rozcieńczenia 1:10. W przypadku słabo wilgotniejących substancji można dodać odpowiedni związek powierzchniowo czynny, np. 0,1% (m/v) polisorbatu 80.
Jeżeli konieczne jest uzyskanie kolejnych dziesiętnych rozcieńczeń, należy użyć roztworu wyjściowego, stosując ten sam rozcieńczalnik, aby osłabić aktywność przeciwdrobnoustrojową produktu lub uzyskać liczbę kolonii od 10 do 100 w celu łatwego zliczenia.
Określenie całkowitej liczby tlenowych drobnoustrojów mezofilnych
a) Filtracja przez błony
Należy stosować 2 błony filtracyjne o średnicy porów nie większej niż 0,45m i których efektywność w zatrzymywaniu bakterii została ustalona. Niżej opisana metoda zakłada stosowanie błon o średnicy ok. 50 mm:
- na każdą błonę przenieść ilość odpowiadającą 0,1 g badanego produktu i natychmiast przesączyć. W celu uzyskania równomiernego rozkładu drobnoustrojów na błonie, można ją przepłukać sterylnym roztworem płuczącym,
- przenieść błony na powierzchnię odpowiedniego podłoża agarowego, inkubować w 30-35C przez 3 dni w przypadku bakterii, 20-25C przez 5 dni w przypadku grzybów, chyba że bardziej wiarygodne zliczenia są osiągalne w krótszym czasie,
-policzyć liczbę wyhodowanych kolonii i przeliczyć liczbę mikroorganizmów na gram lub
mililitr badanego wyrobu.
b) Procedura liczenia płytek:
- stosując płytki Petriego o średnicy 9-10 cm, dodać do każdej płytki 1 ml próbki odpowiadającej 0,1 g wyrobu i ok. 15 ml odpowiedniego płynnego podłoża agarowego o temperaturze nie wyższej niż 45C, wymieszać i pozostawić na chłodnej poziomej powierzchni do zastygnięcia,
- alternatywnie: rozprowadzić rozcieńczony wyrób (zwykle 0,1 ml na płytkę, co odpowiada 0,01 g wyrobu) na powierzchni stałego podłoża na płytce Petriego o średnicy j.w.,
- inkubować płytki jak w przypadku metody filtracyjnej,
- policzyć wyhodowane kolonie i przeliczyć wyniki, używając płytek z największą liczbą kolonii, lecz nie większą niż 300 kolonii dla bakterii i 100 kolonii dla grzybów.
c) Przedstawienie wyników
Należy policzyć i zapisać liczbę jednostek tworzących kolonie (jtk) dla każdej płytki. Wyliczyć całkowitą liczbę jtk/płytkę i przemnożyć wynik przez rozcieńczenie w celu uzyskania ilości jtk/g lub jtk/ml wyrobu.
Wykrywanie określonych drobnoustrojów
Specyficzne drobnoustroje:
Pseudomonas aeruginosa
Na podłożu z cetrimidem (pkt 7 - Roztwory i podłoża hodowlane) typowe kolonie P. aeruginosa są płaskie, przejrzyste, żółto-zielonkawe do niebieskich.
Należy przeprowadzić co najmniej następujące testy potwierdzające:
- barwienie metodą Gramma,
- test oksydazowy,
- test na ruchliwość,
- wzrost w 42C.
P. aeruginosa jest Gram-ujemną pałeczką, ruchliwą, oksydazo-dodatnią i rośnie w temp. 42C.
Staphylococcus aureus
Na podłożu Baird-Parkera (pkt 7 - Roztwory i podłoża hodowlane) typowe kolonie S. aureus są czarne, błyszczące, wypukłe, otoczone przejrzystym obszarem, który może opalizować.
Należy przeprowadzić co najmniej następujące testy potwierdzające:
- barwienie metodą Gramma,
- test katalazowy,
- test koagulazowy.
Gram-dodatnie ziarniaki, katalazo- i koagulazo-dodatnie mogą być uważane za S. aureus.
Candida albicans
Na podłożu Sabouard-dekstrozowym (pkt 7 - Roztwory i podłoża hodowlane) typowe kolonie C. albicans są białe do beżowych, kremowe, wypukłe.
Należy przeprowadzić co najmniej następujące testy potwierdzające:
- badanie mikroskopowe,
- test tworzenia nibystrzępek,
- tworzenie chlamidosporów.
Drożdże tworzące nibystrzępki i dające chlamidospory mogą być uważane za C. Albicans
.W każdym przypadku powinny być prowadzone inne odpowiednie testy, aby potwierdzić identyfikację.
Przedstawienie wyników:
Wyniki należy zapisać w raporcie z badań jako obecność lub nieobecność swoistych mikroorganizmów: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans.

Roztwory i podłoża hodowlane
Poniższe roztwory i podłoża hodowlane powinny być przeznaczone do stosowania zgodnie z przeznaczeniem, jednakże można stosować odpowiednie podłoża suche, pod warunkiem że mają one identyczne właściwości odżywcze i selektywne dla testowych drobnoustrojów.
1.Rozcieńczalnik
Buforowany roztwór chlorku sodu z peptonem o pH 7,0.
Dwuwodorofosforan potasu - 3,56 g odpowiednik
Wodorofosforan sodu - 7,23 g 0,067 M
Chlorek sodu - 4,30 g
Pepton (mięsny lub kazeinowy) - 1,0 g
Woda destylowana - 1000 ml
Wyjaławiać w autoklawie w 121C przez 15 minut.
W razie konieczności można dodać odpowiednie czynniki zobojętniające, np. polisorbat 20
lub 80, lecytynę, tiosiarczan.
2. Podłoże do określania liczby bakterii
Agar z hydrolizatem kazeinowo-sojowym.
Trzustkowy hydrolizat kazeiny - 15,0 g
Papainowy hydrolizat ziaren soi - 5,0 g
Chlorek sodu - 5,0 g
Agar - 15,0 g
Woda destylowana - 1.000 ml
Wyjaławiać 15 minut w autoklawie w temperaturze 121C; pH po wyjałowieniu powinno
wynosić 7,3?0,2.
3. Podłoże do określania liczby grzybów
Pożywka Sabouard-dekstrozowa.
Peptony (mięsny i kazeinowy) - 10,0 g
Dekstroza jednowodna - 40,0 g
Agar - 15,0 g
Woda destylowana - 1.000 ml
Wyjaławiać 15 minut w autoklawie w temperaturze 121C, pH po wyjałowieniu powinno wynosić 5,6?0,2.
4. Podłoże do wykrywania Pseudomonas aeruginosa
Pożywka z cetrimidem.
Trzustkowy hydrolizat żelatyny - 20,0 g
Chlorek magnezu - 1,4 g
Siarczan potasu - 10,0 g
Cetrimid - 0,3 g
Agar - 13,6 g
Glicerol - 10,0 ml
Woda destylowana - 1.000 ml
Wyjaławiać 15 minut w autoklawie w temperaturze 121C; pH po wyjałowieniu powinno wynosić 7,2?0,2.
5. Podłoże do wykrywania Staphylococcus aureus
Pożywka Baird-Parkera.
Trzustkowy hydrolizat kazeiny - 10,0 g
Wyciąg wołowy - 5,0 g
Wyciąg drożdżowy - 1,0 g
Chlorek litu - 5,0 g
Agar - 20,0 g
Glicyna - 12,0 g
Pirogronian sodu - x10,0 g
Woda destylowana - 950 ml
Po wyjałowieniu pH powinno wynosić 6,8?0,2. Wyjaławiać 15 minut w autoklawie w temperaturze 121C, oziębić do 45-50C i dodać sterylnego 1% roztworu telurytu potasu i 50 ml emulsji żółtka jaja kurzego.
6. Podłoże do wykrywania Candida albicans
Pożywka Sabouard-dekstrozowa.
Peptony (mięsny i kazeinowy) - 10,0 g
Dekstroza jednowodna - 40,0 g
Agar - 15,0 g
Woda destylowana - 1.000 ml
Wyjaławiać 15 minut w autoklawie w temperaturze 121C; pH po wyjałowieniu powinno wynosić 5,6?0,2.



Bibliografia:
www.biotechnologia.pl
www.nettax.pl
www.wizaz.pl
inne źródła