Postacie historyczne uwiecznione na obrazie Z krzyżem będąc centralną postacią obrazu stoi król Polski Zygmunt August. W racjonale uwieczniony został Jakub Uchański prymas Polski Klęczy na klęczniku z ręką na Ewangelii, w drugiej trzyma dokument z tekstem aktu unii Marcin Zborowski kasztelan krakowski. W rzeczywistości nie żył od 4 lat, ale był gorącym orędownikiem ujednolicenia podstaw ustrojowych Polski i Litwy i stąd jego obecność na obrazie. Treść przysięgi odczytuje Filip Padniewski biskup krakowski stojący za prymasem. Z mieczem w ręce klęczy Mikołaj Radziwiłł zwany Rudym, jako jedyny litewski senator nie złożył podpisu pod dokumentem unii, a wyciągnięty miecz ma symbolizować wobec króla i unii wrogą postawę. Klęczy także Mikołaj Mielecki w zbroi z buławą hetmańską w prawej ręce. W rzeczywistości godność hetmana wielkiego koronnego otrzymał dopiero w 1578. Na lewo od króla na pierwszym planie zsuwa się z fotela Walerian Protasewicz biskup wileński. Ze względu na stan zdrowia i podeszły wiek nie był obecny w Lublinie. Podtrzymujący go Jan Łaski też nie był w Lublinie, bo zmarł w 1560. W czerwonych kardynalskich sztach na fotelu siedzi Stanisław Hozjusz, oparty o jego fotel stoi Łukasz Górka wojewoda poznański; nie było go w Lublinie, ale Matejko umieścił go, aby symbolizował kolebkę państwa polskiego Wielkopolskę. Z laską marszałkowską sportretowany został Jan Firlej marszałek wielki koronny. W głębi z ręką zgłaszającą się do odpowiedzi widać księcia pruskiego Albrechta Fryderyka Hohenzollerna. Po prawej stronie obrazu stoi siostra króla Anna Jagiellonka, nie było jej w Lublinie, ale umieszczenie jej postaci w koronie na głowie symbolizuje kontynuację dynastycznej polityki Jagiellonów. Malując Annę Matejko wzorował się na zachowanym portrecie królowej w stroju koronacyjnym przechowywanym w Katedrze Wawelskiej. Ubrana na czarno brodata postać to Andrzej Frycz Modrzewski, autor dzieła O naprawie Rzeczypospolitej. Modrzewski na obrazie obejmuje postać chłopa, co symbolizuje głoszoną przezeń ideę zrównania w prawach chłopstwa z mieszczaństwem i szlachtą.
